生物傳感器的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

　　從1962年，Clark和Lyons最先提出生物傳感器的設(shè)想距今已有40 年。生物傳感器在發(fā)酵工藝、環(huán)境監(jiān)測、食品工程、臨床醫(yī)學(xué)、軍事及軍事醫(yī)學(xué)等方面得到了深度重視和廣泛應(yīng)用。在最初15年里，生物傳感器主要是以研制酶電極制作的生物傳感器為主，但是由于酶的價格昂貴并不夠穩(wěn)定，因此以酶作為敏感材料的傳感器，其應(yīng)用受到一定的限制。

　　近些年來，微生物固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了微生物電極。微生物電極以微生物活體作為分子識別元件，與酶電極相比有其獨到之處。它可以克服價格昂貴、提取困難及不穩(wěn)定等弱點。此外，還可以同時利用微生物體內(nèi)的輔酶處理復(fù)雜反應(yīng)。而目前，光纖生物傳感器的應(yīng)用也越來越廣泛。而且隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）的發(fā)展，應(yīng)用PCR的DNA生物傳感器也越來越多。

　　二、 研究現(xiàn)狀及主要應(yīng)用領(lǐng)域

　　1、 發(fā)酵工業(yè)

　　各種生物傳感器中，微生物傳感器最適合發(fā)酵工業(yè)的測定。因為發(fā)酵過程中常存在對酶的干擾物質(zhì)，并且發(fā)酵液往往不是清澈透明的，不適用于光譜等方法測定。而應(yīng)用微生物傳感器則極有可能消除干擾，并且不受發(fā)酵液混濁程度的限制。同時，由于發(fā)酵工業(yè)是大規(guī)模的生產(chǎn)，微生物傳感器其成本低設(shè)備簡單的特點使其具有極大的優(yōu)勢。

　?。?）。 原材料及代謝產(chǎn)物的測定

　　微生物傳感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的測定，代謝產(chǎn)物如頭孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇類、青霉素、乳酸等的測定。測量的原理基本上都是用適合的微生物電極與氧電極組成，利用微生物的同化作用耗氧，通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量，從而達(dá)到測量底物濃度的目的。

　　在各種原材料中葡萄糖的測定對過程控制尤其重要，用熒光假單胞菌（Psoudomonas fluorescens）代謝消耗葡萄糖的作用，通過氧電極進(jìn)行檢測，可以估計葡萄糖的濃度。這種微生物電極和葡萄糖酶電極型相比，測定結(jié)果是類似的，而微生物電極靈敏度高，重復(fù)實用性好，而且不必使用昂貴的葡萄糖酶。

　　當(dāng)乙酸用作碳源進(jìn)行微生物培養(yǎng)時，乙酸含量高于某一濃度會抑制微生物的生長，因此需要在線測定。用固定化酵母（Trichosporon brassicae），透氣膜和氧電極組成的微生物傳感器可以測定乙酸的濃度。

　　此外，還有用大腸桿菌（E.coli）組合二氧化碳?xì)饷綦姌O，可以構(gòu)成測定谷氨酸的微生物傳感器，將檸檬酸桿菌完整細(xì)胞固定化在膠原蛋白膜內(nèi)，由細(xì)菌—膠原蛋白膜反應(yīng)器和組合式玻璃電極構(gòu)成的微生物傳感器可應(yīng)用于發(fā)酵液中頭孢酶素的測定等等。

　?。?）。 微生物細(xì)胞總數(shù)的測定

　　在發(fā)酵控制方面，一直需要直接測定細(xì)胞數(shù)目的簡單而連續(xù)的方法。人們發(fā)現(xiàn)在陽極表面，細(xì)菌可以直接被氧化并產(chǎn)生電流。這種電化學(xué)系統(tǒng)已應(yīng)用于細(xì)胞數(shù)目的測定，其結(jié)果與傳統(tǒng)的菌斑計數(shù)法測細(xì)胞數(shù)是相同的[1]。

　?。?）。 代謝試驗的鑒定

　　傳統(tǒng)的微生物代謝類型的鑒定都是根據(jù)微生物在某種培養(yǎng)基上的生長情況進(jìn)行的。這些實驗方法需要較長的培養(yǎng)時間和專門的技術(shù)。微生物對底物的同化作用可以通過其呼吸活性進(jìn)行測定。用氧電極可以直接測量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物傳感器來測定微生物的代謝特征。這個系統(tǒng)已用于微生物的簡單鑒定、微生物培養(yǎng)基的選擇、微生物酶活性的測定、廢水中可被生物降解的物質(zhì)估計、用于廢水處理的微生物選擇、活性污泥的同化作用試驗、生物降解物的確定、微生物的保存方法選擇等[2]。

　　2、 環(huán)境監(jiān)測

　　（1）。 生化需氧量的測定

　　生化需氧量（biochemical oxygen dem–BOD）的測定是監(jiān)測水體被有機物污染狀況的最常用指標(biāo)。常規(guī)的BOD測定需要5天的培養(yǎng)期，操作復(fù)雜、重復(fù)性差、耗時耗力、干擾性大，不宜現(xiàn)場監(jiān)測，所以迫切需要一種操作簡單、快速準(zhǔn)確、自動化程度高、適用廣的新方法來測定。目前，有研究人員分離了兩種新的酵母菌種SPT1和SPT2，并將其固定在玻璃碳極上以構(gòu)成微生物傳感器用于測量BOD，其重復(fù)性在±10%以內(nèi)。將該傳感器用于測量紙漿廠污水中BOD的測定，其測量最小值可達(dá)2 mg/l，所用時間為5min[3]。還有一種新的微生物傳感器，用耐高滲透壓的酵母菌種作為敏感材料，在高滲透壓下可以正常工作。并且其菌株可長期干燥保存，浸泡后即恢復(fù)活性，為海水中BOD的測定提供了快捷簡便的方法[4]。

　　除了微生物傳感器，還有一種光纖生物傳感器已經(jīng)研制出來用于測定河水中較低的BOD值。該傳感器的反應(yīng)時間是15min，最適工作條件為30°C，pH=7。這個傳感器系統(tǒng)幾乎不受氯離子的影響（在1000mg/l范圍內(nèi)），并且不被重金屬（Fe3+、Cu2+、Mn2+、Cr3+、Zn2+）所影響。該傳感器已經(jīng)應(yīng)用于河水BOD的測定，并且獲得了較好的結(jié)果[4]。

　　現(xiàn)在有一種將BOD生物傳感器經(jīng)過光處理（即以TiO2作為半導(dǎo)體，用6 W燈照射約4min）后，靈敏度大大提高，很適用于河水中較低BOD的測量[5]。同時，一種緊湊的光學(xué)生物傳感器已經(jīng)發(fā)展出來用于同時測量多重樣品的BOD值。它使用三對發(fā)光二極管和硅光電二極管，假單胞細(xì)菌（Pseudomonas fluorescens）用光致交聯(lián)的樹脂固定在反應(yīng)器的底層，該測量方法既迅速又簡便，在4℃下可使用六周，已經(jīng)用于工廠廢水處理的過程中[5]。

　?。?）。 各種污染物的測定

　　常用的重要污染指標(biāo)有氨、亞鹽、硫化物、磷酸鹽、致癌物質(zhì)與致變物質(zhì)、重金屬離子、酚類化合物、表面活性劑等物質(zhì)的濃度。目前已經(jīng)研制出了多種測量各類污染物的生物傳感器并已投入實際應(yīng)用中了。

　　測量氨和鹽的微生物傳感器，多是用從廢水處理裝置中分離出來的硝化細(xì)菌和氧電極組合構(gòu)成。目前有一種微生物傳感器可以在黑暗和有光的條件下測量鹽和亞鹽（NOx-），它在鹽環(huán)境下的測量使得它可以不受其他種類的氮的氧化物的影響。用它對河口的NOx-進(jìn)行了測量，其效果較好[6]。

　　硫化物的測定是用從硫鐵礦附近酸性土壤中分離篩選得到的專性、自養(yǎng)、好氧性氧化硫硫桿菌制成的微生物傳感器。在pH=2.5、31℃時一周測量200余次，活性保持不變，兩周后活性降低20%。傳感器壽命為7天，其設(shè)備簡單，成本低，操作方便。目前還有用一種光微生物電極測硫化物含量，所用細(xì)菌是Chromatium.SP，與氫電極連接構(gòu)成[7]。

　　最近科學(xué)家們在污染區(qū)分離出一種能夠發(fā)熒光的細(xì)菌，此種細(xì)菌含有熒光基因，在污染源的刺激下能夠產(chǎn)生熒光蛋白，從而發(fā)出熒光?？梢酝ㄟ^遺傳工程的方法將這種基因?qū)牒线m的細(xì)菌內(nèi)，制成微生物傳感器，用于環(huán)境監(jiān)測?，F(xiàn)在已經(jīng)將熒光素酶導(dǎo)入大腸桿菌（E.coli）中，用來檢測砷的有毒化合物[8]。

　　水體中酚類和表面活性劑的濃度測定已經(jīng)有了很大的發(fā)展。目前，有9種革蘭氏陰性細(xì)菌從西西伯利亞石油盆地的土壤中分離出來，以酚作為唯一的碳源和能源。這些菌種可以提高生物傳感器的感受器部分的靈敏度。它對酚的監(jiān)測極限為5 ?10-9mol。該傳感器工作的最適條件為：pH=7.4、35℃，連續(xù)工作時間為30h[9]。還有一種假單胞菌屬（Pseudomonas rathonis）制成的測量表面活性劑濃度的電流型生物傳感器，將微生物細(xì)胞固定在凝膠（瓊脂、瓊脂糖和海藻酸鈣鹽）和聚乙醇膜上，可以用層析試紙GF/A，或者是谷氨酸醛引起的微生物細(xì)胞在凝膠中的交聯(lián)，長距離的保持它們在高濃度表面活性劑檢測中的活性和生長力。該傳感器能在測量結(jié)束后很快的恢復(fù)敏感元件的活性[10]。

　　還有一種電流式生物傳感器，用于測定有機磷殺蟲劑，使用的是人造酶。利用有機磷殺蟲劑水解酶，對硝基酚和二乙基酚的測量極限為100?10-9mol，在40℃只要4min[11]。還有一種新發(fā)展起來的磷酸鹽生物傳感器，使用丙酮酸氧化酶G，與自動系統(tǒng)CL-FIA臺式電腦結(jié)合，可以檢測（32~96）？10-9mol的磷酸鹽，在25°C下可以使用兩周以上，重復(fù)性高[12]。

　　最近，有一種新型的微生物傳感器，用細(xì)菌細(xì)胞作為生物組成部分，測定地表水中壬基酚（nonyl-phenol etoxylate --NP-80E）的含量。用一個電流型氧電極作傳感器，微生物細(xì)胞固定在氧電極上的透析膜上，其測量原理是測量毛孢子菌屬（Trichosporum grablata）細(xì)胞的呼吸活性。該生物傳感器的反應(yīng)時間為15~20min，壽命為7~10天（用于連續(xù)測定時）。在濃度范圍0.5~6.0mg/l內(nèi)，電信號與NP-80E濃度呈線性關(guān)系，很適合于污染的地表水中分子表面活性劑的檢測[13]。

　　除此之外，污水中重金屬離子濃度的測定也是不容忽視的。目前已經(jīng)成功設(shè)計了一個完整的，基于固定化微生物和生物體發(fā)光測量技術(shù)上的重金屬離子生物有效性測定的監(jiān)測和分析系統(tǒng)。將弧菌屬細(xì)菌（Vibrio fischeri）體內(nèi)的一個操縱子在一個銅誘導(dǎo)啟動子的控制下導(dǎo)入產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌（Alcaligenes eutrophus （AE1239））中，細(xì)菌在銅離子的誘導(dǎo)下發(fā)光，發(fā)光程度與離子濃度成正比。將微生物和光纖一起包埋在聚合物基質(zhì)中，可以獲得靈敏度高、選擇性好、測量范圍廣、儲藏穩(wěn)定性強的生物傳感器。目前，這種微生物傳感器可以達(dá)到最低測量濃度1?10-9mol[14]。

　　還有一種專門測量銅離子的電流型微生物傳感器。它用酒釀酵母（Saccharomyces cerevisiae）重組菌株作為生物元件，這些菌株帶有酒釀酵母CUP1基因上的銅離子誘導(dǎo)啟動子與大腸桿菌lacZ基因的融合體。其工作原理，首先是CUP1啟動子被Cu2+誘導(dǎo)，隨后乳糖被用作底物進(jìn)行測量。如果Cu2+存在于溶液中，這些重組體細(xì)菌就可以利用乳糖作為碳源，這將導(dǎo)致這些好氧細(xì)胞需氧量的改變。該生物傳感器可以在濃度范圍（0.5~2）？10-3mol范圍內(nèi)測定CuSO4溶液。目前已經(jīng)將各類金屬離子誘導(dǎo)啟動子轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，使得大腸桿菌會在含有各種金屬離子的的溶液中出現(xiàn)發(fā)光反應(yīng)。根據(jù)它發(fā)光的強度可以測定重金屬離子的濃度，其測量范圍可以從納摩爾到微摩爾，所需時間為60~100min[15][16]。

　　用于測量污水中鋅濃度的生物傳感器也已經(jīng)研制成功，使用嗜堿性細(xì)菌Alcaligenes cutrophus，并用于對污水中鋅的濃度和生物有效性進(jìn)行測量，其結(jié)果令人滿意[17]。

　　估測河口出水流污染情況的海藻傳感器是由一種螺旋藻屬藍(lán)細(xì)菌（ cyanobacterium Spirlina subsalsa）和一個氣敏電極構(gòu)成的。通過監(jiān)測光合作用被抑制的程度來估測由于環(huán)境污染物的存在而引起水的毒性變化。以標(biāo)準(zhǔn)天然水為介質(zhì)，對三種主要污染物（重金屬、除草劑、氨基甲酸鹽殺蟲劑）的不同濃度進(jìn)行了測定，均可監(jiān)測到它們的有毒反應(yīng)，重復(fù)性和再生性都很高[18]。

　　近來由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）的迅猛發(fā)展及其在環(huán)境監(jiān)測方面的廣泛應(yīng)用，不少科學(xué)家開始著手于將它與生物傳感器技術(shù)結(jié)合應(yīng)用。有一種應(yīng)用PCR技術(shù)的DNA壓電生物傳感器，可以測定一種特殊的細(xì)菌毒素。將生物素酰化的探針固定在裝有鏈酶抗生素鉑金表面的石英晶體上，用1?10-6mol的鹽酸可以使循環(huán)式測量在同一晶體表面進(jìn)行。用細(xì)菌中提取的DNA樣品進(jìn)行同樣的雜交反應(yīng)并由PCR放大，產(chǎn)物為氣單胞菌屬（Aeromonas hydrophila）的一種特殊基因片斷。這種壓電生物傳感器可以鑒別樣品中是否含有這種基因，這為從水樣中檢測是否含帶有這種病原的各種氣單胞菌提供了可能[19]。

　　還有一種通道生物傳感器可以檢測浮游植物和水母等生物體產(chǎn)生的腰鞭毛蟲神經(jīng)毒素等毒性物質(zhì)，目前已經(jīng)能夠測量在一個浮游生物細(xì)胞內(nèi)含有的極微量的PSP毒素[20]。DNA傳感器也在迅速的得到應(yīng)用，目前有一種小型化DNA生物傳感器，能將DNA識別信號轉(zhuǎn)換為電信號，用于測量水樣中隱孢子和其他水源傳染體。該傳感器著重于改進(jìn)核酸的識別作用和加強該傳感器的特異性和靈敏性，并尋求將雜交信號轉(zhuǎn)化為有用信號的新方法，目前研究工作為識別裝置和轉(zhuǎn)換裝置的一體化[21]。

　　微藻素是一種從藍(lán)藻細(xì)菌引起的水華中產(chǎn)生的細(xì)菌肝毒素，一種固定有表面細(xì)胞質(zhì)?；蚪M的生物傳感器已經(jīng)制得，用于測量水中微藻素的含量，它直接的測量范圍是50~1000 ?10-6g/l[22]。

　　一種基于酶的抑制性分析的多重生物傳感器用于測量毒性物質(zhì)的設(shè)想也已經(jīng)提出。在這種多重生物傳感器中，應(yīng)用了兩種傳導(dǎo)器—對pH敏感的電子晶體管和熱敏性的薄膜電極，以及三種酶—尿素酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。該生物傳感器的性能已經(jīng)得到測試，效果較好[23]。

　　除了發(fā)酵工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測，生物傳感器還深入的應(yīng)用于食品工程、臨床醫(yī)學(xué)、軍事及軍事醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，主要用于測量葡萄糖、乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各種氨基酸，以及各種致癌和致變物質(zhì)。

　　三、 討論與展望

　　美國的Harold H.Weetal指出，生物傳感器商品化要具備以下幾個條件：足夠的敏感性和準(zhǔn)確性、易操作、價格便宜、易于批量生產(chǎn)、生產(chǎn)過程中進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。其中，價格便宜決定了傳感器在市場上有無競爭力。而在各種生物傳感器中，微生物傳感器最大的優(yōu)點就是成本低、操作簡便、設(shè)備簡單，因此其在市場上的前景是十分巨大和誘人的。相比起來，酶生物傳感器等的價格就比較昂貴。但微生物傳感器也有其自身的缺點，主要的缺點就是選擇性不夠好，這是由于在微生物細(xì)胞中含有多種酶引起的?，F(xiàn)已有報道加專門抑制劑以解決微生物電極的選擇性問題。除此之外，微生物固定化方法也需要進(jìn)一步完善，首先要盡可能保證細(xì)胞的活性，其次細(xì)胞與基礎(chǔ)膜結(jié)合要牢固，以避免細(xì)胞的流失。另外，微生物膜的長期保存問題也待進(jìn)一步的改進(jìn)，否則難于實現(xiàn)大規(guī)模的商品化。

　　總之，常用的微生物電極和酶電極在各種應(yīng)用中各有其優(yōu)越之處。若容易獲得穩(wěn)定、高活性、低成本的游離酶，則酶電極對使用者來說是最理想的。相反的，若生物催化需經(jīng)過復(fù)雜途徑，需要輔酶，或所需酶不宜分離或不穩(wěn)定時，微生物電極則是更理想的選擇。而其他各種形式的生物傳感器也在蓬勃發(fā)展中，其應(yīng)用也越來越廣泛。隨著固定化技術(shù)的進(jìn)一步完善，隨著人們對生物體認(rèn)識的不斷深入，生物傳感器必將在市場上開辟出一片新的天地。