下面簡(jiǎn)單介紹通過醫(yī)用離心機(jī)進(jìn)行“腎單層細(xì)胞培養(yǎng)”的一般操作技術(shù)。
1.取腎：用無菌操作取出斷乳前后幼齡動(dòng)物的腎臟置滅菌平皿中，http://www.sklxj.com剪去留的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎盂及髓質(zhì)部分，用含雙抗(指青、鏈霉素，下同)的漢克氏液洗凈，移置小燒杯中，剪成乳糜狀，再用漢克氏液洗2—3次，至液體澄清無血細(xì)胞為止。
2.消化；加入10倍的0.125％胰酶液進(jìn)行消化。有熱消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)兩種。消化的時(shí)間根據(jù)不同的組織細(xì)胞和所用胰酶的活性而定，直至聚成絮狀的腎組織又分散開。取出傾去胰酶，用漢克氏液洗滌數(shù)次，然后加入少量乳漢液，用吸管進(jìn)行吹打(即吸入和吹出)10-20次，使組織分散為細(xì)胞。將分散的細(xì)胞經(jīng)2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于醫(yī)用離心機(jī)中以1500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過離心機(jī)離心，最后加入乳漢液使細(xì)胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
3.細(xì)胞計(jì)數(shù)和分裝：取已制好的細(xì)胞懸浮液，用計(jì)數(shù)白細(xì)胞的方法計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用營(yíng)養(yǎng)液(pH6.8—7.0)稀釋為每毫升含50-60萬細(xì)胞，分裝于小扁瓶中(容量約50毫升的扁瓶加懸液約5毫升)，也可分裝在鏈霉素小瓶中。
4.培養(yǎng)：在37℃培養(yǎng)，3—4天即可粘附瓶壁形成單層細(xì)胞，以后每過3—4大更換一次維持液。
5.接毒；將病料剪碎，按1：4加含雙抗的漢克氏液研磨成乳糜狀，經(jīng)凍融處理使細(xì)胞破碎，病毒充分釋放，用離心機(jī)，將轉(zhuǎn)速控制在3000轉(zhuǎn)/分左右離心15分鐘，將上清液接種到已生長(zhǎng)單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，在37℃溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。
6.收獲病毒：每日或隔日用低倍顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)有50-75％細(xì)胞出現(xiàn)病變隊(duì)時(shí)可收集培養(yǎng)瓶中液體，從放在冰箱(-20℃)中保存，此即繁殖的病毒液。
注：培養(yǎng)皿及其他使用器具的潔凈、離心機(jī)的使用、水的質(zhì)量、酸堿度、無菌操作等，都是關(guān)系到組織培養(yǎng)成敗的重要問題，必須嚴(yán)格規(guī)定的要求去做。